María Canive, doctora por la Universidad del País Vasco/ Euskal Herriko Uniberstsitatea (UPV/EHU) ha dedicado su tesis, llevada a cabo en el Departamento de Sanidad Animal de NEIKER, a estudiar los marcadores inmunológicos y genéticos asociados a infecciones causadas por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) en ganado bovino.
La paratuberculosis (PTB) bovina es una enteritis granulomatosa crónica causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) que afecta a rumiantes tanto domésticos como silvestres. La PTB compromete la salud y bienestar animal y supone un importante problema económico y social. La PTB es una enfermedad de distribución mundial y las pérdidas económicas que provoca se deben principalmente a la muerte prematura de animales infectados, al descenso en la fertilidad y la producción láctea y a la mayor susceptibilidad a otras enfermedades. Además, la asociación de MAP con la enfermedad de Crohn y otras enfermedades inflamatorias gastrointestinales como la colitis ulcerosa o la enfermedad inflamatoria intestinal así como con enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, la diabetes tipo I o la esclerosis múltiple en humanos le convierte en un patógeno potencialmente zoonósico. Por estos motivos, la Organización Mundial de Sanidad Animal, ha catalogado a la PTB como una enfermedad de declaración obligatoria.
Aunque se ha demostrado que la vacunación es la mejor herramienta para el control de la enfermedad son pocos los países en la que está autorizada debido a las posibles interferencias con el diagnóstico de la tuberculosis. En la actualidad, el control de la enfermedad se fundamenta en la aplicación de medidas higiénico-sanitarias en las explotaciones ganaderas y en el diagnóstico y eliminación de animales infectados. Sin embargo, la eficacia de estas estrategias de control están fuertemente condicionadas por la disponibilidad de recursos económicos en las explotaciones ganaderas y por la falta de sensibilidad de los test diagnósticos para detectar animales subclínicos, poniendo de manifiesto la necesidad de desarrollar nuevas herramientas que permitan la detección de animales subclínicos y un diagnóstico temprano de la infección.
Imagen de MAP y tinción Ziehl Neelsen (ZN) de una muestra de tejido intestinal de una vaca infectada con MAP. A la izquierda fotografía de MAP obtenida con un microscopio electrónico de barrido (https://johnes.org/). A la derecha tinción ZN de una sección de tejido intestinal de una vaca infectada con MAP. La bacteria se observa de un color rosado intenso (40x) (Vázquez, P)
¿Provoca la infección por MAP cambios significativos en la expresión de genes del hospedador?
Para averiguarlo, María se ha centrado en identificar genes diferencialmente expresados en muestras de sangre periférica y válvula ileocecal de vacas frisonas con distintos tipos de lesiones de PTB (lesiones focales y difusas) respecto a animales control, sin lesiones, utilizando la tecnología de secuenciación masiva de RNA (RNA-Seq). El análisis proporcionó información valiosa sobre la respuesta del hospedador a una infección natural con MAP, y permitió identificar genes, procesos biológicos, rutas metabólicas y redes de proteínas, desregulados en animales con lesiones focales y difusas que no habían sido previamente descritos, como la inhibición de la vía de señalización de CXCL8/IL8.
¿Se podrían utilizar estos genes como nuevos biomarcadores para el diagnóstico de animales subclínicos?
El desarrollo de las nuevas técnicas de secuenciación masiva, como el RNA-Seq, ofrece nuevas posibilidades para conocer la interacción MAP-hospedador a un nivel más completo y para identificar biomarcadores que puedan ser utilizados en el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico, agentes terapéuticos y vacunas. En esta tesis doctoral, el análisis de la información obtenida mediante la tecnología RNA-Seq, mostró que el gen más sobre-expresado en las muestras de válvula ileocecal de los animales infectados fue el precursor de la intelectina 2 (ITLN2), lo que sugería que podría ser utilizado como biomarcador de la infección por MAP en muestras de tejido. Por otro lado, el gen más sobre-expresado en muestras de sangre periférica de animales con lesiones focales, el transportador ABCA13, fue seleccionado como un posible biomarcador de la infección subclínica. Consideramos que las proteínas codificadas por los genes diferencialmente expresados podrían ser utilizadas como biomarcadores y permitir el desarrollo de nuevos test diagnósticos capaces de detectar animales subclínicos difícilmente detectables con las técnicas de diagnóstico tradicionales. Con estos nuevos métodos de diagnóstico basados en biomarcadores sería posible detectar a todos los animales infectados en la explotación, clínicos y subclínicos, lo que permitiría una posible certificación referente al status sanitario de las explotaciones en cuanto a la PTB. Esto sería deseable de cara a ofrecer productos seguros al consumidor, obtener una posición privilegiada para la venta de productos de origen animal o disponer de un listado de ganaderías libres de PTB donde poder adquirir animales sanos para la recría. En estudios realizados posteriormente en colaboración con el área de Sanidad Animal del SERIDA, se confirmó y validó el potencial de la ITLN2 y del ABCA13 como biomarcadores diagnósticos facilitando ambos la detección de animales con lesiones focales asociadas a la PTB, y difícilmente detectables con los métodos tradicionales de diagnóstico.
¿Es posible identificar variantes genéticas causales de la PTB? ¿Es posible la selección genética de animales menos susceptibles a la infección por MAP?
Una de las ventajas que presenta la tecnología RNA-Seq es que la información obtenida puede combinarse con datos de genotipado para, mediante un enfoque genómico-transcriptómico, identificar variantes alélicas reguladoras de genes potencialmente causales de enfermedades. La identificación de variantes alélicas asociadas a cambios de expresión de genes potencialmente causales de la PTB tendría un gran potencial desde el punto de vista de la selección genómica porque permitiría seleccionar animales menos susceptibles a la infección. Este es un enfoque muy novedoso y del que no existían estudios previos en el campo de la PTB. En el trabajo realizado por Maria en su Tesis Doctoral, la integración de datos de expresión génica obtenidos mediante RNA-Seq y datos de genotipado de animales infectados con MAP en condiciones naturales, permitió la identificación de variantes génicas reguladoras de la expresión de genes o cis-eQTLS. Tres de estos cis-eQTLs regulaban la expresión de los genes MECOM, eEF1A2 y U1 y fueron asociados con la susceptibilidad a la infección por MAP mediante un estudio de asociación genética dirigida. El genotipo heterocigoto para el cis-eQTL regulador del gen MECOM, se asociaba con resultados positivos a los test de ELISA, PCR y cultivo bacteriológico, con mayores niveles de MECOM en el plasma de animales infectados con MAP, con una mayor supervivencia intracelular de MAP en ensayos ex vivo llevados a cabo con macrófagos bovinos y con un mayor riesgo de progresión a PTB clínica. Estos resultados sugieren que determinadas variantes alélicas del cis-eQTL regulador de la expresión del gen MECOM, podrían causar una respuesta inflamatoria incontrolada y progresiva que exacerbaría el daño tisular en los animales infectados por MAP.
Explorar la base genética de la enfermedad es necesario para una mejor comprensión de la misma y para la identificación de las variantes genéticas asociadas a la PTB. En la presente Tesis Doctoral se ha realizado un estudio de asociación genética empleando los genotipos de una población de vacas de raza frisona (N= 983) y los resultados combinados de ELISA, PCR y cultivo de tejidos. También se han analizado las asociaciones de estos genotipos con los resultados del análisis histopatológico de los animales estudiados, algo que no se había realizado anteriormente. En el primer estudio, la combinación de los resultados de ELISA-PCR y cultivo permitió identificar 159 polimorfismos de nucleótido único (Single nucleotide polimorphism; SNP) asociados a la susceptibilidad a la infección por MAP. En el segundo estudio se identificaron un total de 129 y 92 SNPs asociados con la presencia de lesiones multifocales y difusas, respectivamente. No se encontraron SNPs comunes asociados a ambos tipos de formas lesionales lo que sugiere que puedan ser indicativas de mecanismos divergentes. Así mismo, se identificaron genes candidatos implicados en el proceso de queratinización en los animales con lesiones multifocales, mientras que en los animales con lesiones difusas se identificaron genes candidatos relacionados con el metabolismo del colesterol lo que se confirmó funcionalmente al detectarse niveles más bajos de colesterol en el plasma de animales con lesiones difusas.
María en una jornada de muestreo durante el estudio.
¿Es posible seleccionar animales con un perfil genético específico capaces de tolerar la enfermedad y no desarrollar lesiones histopatológicas?
Aunque la susceptibilidad a la infección por MAP ha sido previamente estudiada, el conocimiento de la genética subyacente a la tolerancia a la enfermedad y de los mecanismos moleculares y celulares que la controlan es limitado. En la presente Tesis Doctoral se ha abordado el estudio de la tolerancia a la PTB mediante el uso de datos de genotipado a secuencia completa y una combinación de test diagnósticos con los que se confirma que el animal se ha infectado (PCR y cultivo de tejidos positivos) pero no ha desarrollado lesiones asociadas a la enfermedad.
El estudio de asociación genética a genoma completo permitió identificar un total de 40 SNPs y 98 genes candidatos asociados a la tolerancia a la PTB. El análisis de enriquecimiento funcional utilizando los genes candidatos identificados permitió definir un perfil inmunogenético específico en los animales tolerantes, diseñado para reparar daños en el DNA, controlar la carga bacteriana, modular la inflamación, limitar el daño tisular, y favorecer el establecimiento de una infección persistente.
En resumen, ¿cuáles son los resultados más importantes obtenidos en esta tesis doctoral y cuáles son sus aplicaciones?
En conjunto, los resultados obtenidos en la Tesis Doctoral proporcionan información nueva y global acerca de los mecanismos moleculares subyacentes a la susceptibilidad a la infección por MAP y a la tolerancia a la PTB con aplicaciones en el diagnóstico y control de la enfermedad. El uso de algunos de los biomarcadores identificados mediante RNA-Seq ha permitido el desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico para la detección de animales subclínicos, difícilmente detectables con los métodos de diagnóstico tradicionales. Además, los SNPs identificados se han integrado en el Chip que habitualmente utiliza CONAFE en sus evaluaciones genéticas de manera que en un futuro puedan ser utilizados para seleccionar animales menos susceptibles a la infección y más tolerantes a la PTB. La aplicación de esta estrategia se traduciría en la disponibilidad de una herramienta preventiva, complementaria a las medidas de control ya existentes, para reducir el impacto económico de la enfermedad. La selección de estos animales beneficiaría especialmente a aquellas áreas geográficas con una alta prevalencia de la enfermedad y donde la vacunación no está permitida. Además, la mejora genética en cuanto a la tolerancia a la PTB podría conducir a mejoras simultáneas en la tolerancia a otras enfermedades y en una mejora en la longevidad, lo que repercutiría en una mayor productividad al ser capaces de aumentar el número de lactaciones por animal y reducir el reemplazo de animales. Los mecanismos asociados a tolerancia a enfermedades parecen ser inespecíficos, por lo que la selección de animales más tolerantes a la PTB también podría generar tolerancia a otros agentes estresantes y enfermedades lo que se traduciría, a su vez, en una disminución en el uso de antibióticos.
Interacción entre la genética del hospedador y la infección con MAP en el fenotipo del hospedador.
En resumen, en la Tesis Doctoral se ha definido un perfil inmunogenético asociado a la tolerancia a la PTB y perfiles de susceptibilidad a la infección relacionados con la aparición de lesiones multifocales o difusas. Se identificaron genes candidatos implicados en el proceso de queratinización asociados a los animales con lesiones multifocales, mientras que en los animales con lesiones difusas se identificaron genes candidatos relacionados con el metabolismo del colesterol. El análisis de enriquecimiento funcional utilizando los genes candidatos identificados permitió definir un perfil inmunogenético específico en los animales tolerantes, diseñado para reparar daños en el DNA, controlar la carga bacteriana, modular la inflamación, limitar el daño tisular, y favorecer la reparación de tejidos. Por último la presencia del alelo menor en los cis-eQTL reguladores de la expresión de los genes MECOM y U1 podría causar una respuesta inflamatoria progresiva que exacerbaría el daño tisular en los animales infectados por MAP.
Datos de la Tesis:
Título: “Marcadores inmunológicos y genéticos asociados a infecciones causadas por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en ganado bovino”.
Directora de tesis: Marta Alonso
Centro: Departamento de Sanidad Animal, NEIKER
Financiación: El desarrollo de este trabajo ha sido posible gracias a los proyectos de investigación: " Marcadores inmunológicos y genéticos asociados a infecciones latentes o patentes causadas por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis" (RTA 2014-00009-CO2-01, MARKPARA) financiado por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), y "Soluciones innovadoras e integradas para el control de la paratuberculosis bovina basadas en genómica, transcriptómica y digital PCR (ddPCR)" (RTI2018-094192-R-C21, PARACON) financiado por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. El desarrollo de la Tesis ha sido posible gracias a una beca FPI-INIA para la formación de personal investigador (FPI2016-00041) de la convocatoria CPD2016-0016.
Para el desarrollo de esta Tesis Doctoral, se ha contado con la colaboración del Departamento de Matemática Aplicada de NEIKER, del Área de Sanidad Animal del Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agroalimentario del Principado de Asturias (SERIDA), del departamento de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal (UPV/EHU), de la Confederación de Asociaciones de Frisona Española (CONAFE) y de la red académica i2basque. La presente Tesis Doctoral ha sido redactada en la modalidad de compendio de publicaciones, dando lugar a cinco publicaciones cientificas, que mantienen una misma unidad temática y se integran en esta Tesis Doctoral: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31619718/ ; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33432064/ ; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34449805/ ; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34635747/ ; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35464478/
